skip to Main Content

Read this blog in:

  • English
  • Français
  • Dansk

Proteinrensning, type VI-pili og integrativ strukturel biologi – en opdatering fra Paris

Tiden flyver afsted I den videnskabelige verden. Man starter sin PhD og pludselig er det første år gået. Når man flytter til et nyt land, væk fra de trygge rammer i ens hjemland, bliver det meste af tiden brugt op at tilpasse sig de nye kulturelle indtryk, opbygge et professionelt og socialt netværk, og sidst men ikke mindst falde på plads i et nyt laboratorie og komme ind i et nyt og spændende projekt. Efter det første år er det lykkedes at håndtere mange af de udfordringer og ydermere er der også sket en stor udvikling både på det personlige og professionelle plan.

Da jeg startede min uddannelse og kom dybere ind i naturvidenskaben og biokemien, fik vi at vide at ”succesraten” når man udfører eksperimenter er på 10%. Derfor kommer man til at opleve mange flere fiaskoer end positive resultater. Fiaskoer er måske for meget sagt, men at resultatet ikke bekræfter den hypotese der lå til grund for eksperimentet. I opstartsfasen af et protein orienteret strukturelt biologisk projekt, skal man producere og oprense anseelige mængder protein, før yderligere eksperimenter kan blive udført. Hvis oprensningen af proteinet giver problemer, kan det føles som om projektet går i stå og de mere avancerede og spændende eksperimenter ligger og venter langt ude i (tids)horisonten. Dette har været tilfældet for mit projekt, men det klarer op på himlen og en solstråle ser ud til at have ramt min proteinoprensning i laboratoriet.

Dette betyder at de kommende og mere interessante eksperimenter er kommer meget tættere på og min motivation er igen blevet større. Meningen med projektet er kommet tættere på og titlen på mit projekt beskriver hvad der kommer til at ske i den kommende tid: “En integrerende strategi til strukturbestemmelse af bakterielle type IV pili”.

Type VI pili

Bakterielle type IV pili er proteinholdige polymere som stikker ud fra bakteriecellers overflade for at udføre en biologisk funktion. Type IV pili´s biologiske funktion er meget alsidig og kan variere fra at promovere motilitet, DNA-optagelse og også fremme infektion af visse patogene bakteriearter. Pili bliver samlet af et meget komplekst proteinmaskineri som er placeret i begge cellemembraner i Gram negative bakterier. Dette proteinmaskineri kan aktivt forlænge og tilbagetrække pili ved hjælp af ATPase motorer.

Pilusen selv er sammensat af tusindevis af protein byggesten, kaldet pilins, og kan blive flere µm lang. Pilins er opdelt i to grupper, ”major” og ”minor” pilins. Den ”major” pilin er et enkelt protein som er tilstede i mange meget højere antal sammenlignet med de ”minor” pilins. Den ”major” pilin udgør dermed hovedparten af den enkelte pilus. De ”minor” pilins er tilstede i meget lavere antal, og det er blevet påvist at de er meget vigtige for den biologiske funktion og endda for selve formationen af pili. I mit projekt fokusere på at bestemme strukturen af de ”minor” pilins og deres interaktioner med hinanden. Dette arbejde bygger videre på forgående arbejde som er blevet udført i laboratoriet hvor strukturen af pili bestående af den ”major” pilins blev bestemt.

Integrativ strukturel bestemmelse

NMR-strukturen af PpdD bliver modelleret ind i cryo elektron mikroskopi data.

PhD consortiummet, ViBrANT, havde lavet en aftale med Medical Microbiology and Immunology om at udgive et ”special issue”, hvor os 15 ESRs skulle skrive et mini-review omhandlende vores projekter. Dette var en rigtig god mulighed til at komme dybere ind i litteraturen og fra start af få en dybdegående baggrundsviden omkring projektet. Udfra de mange relevante artikler, var det meget klart at det kræver en bred pallette af strukturel biologiske tekniker, for at bestemme strukturen af pili og de individuelle pilins. Strukturen af de individuelle pilins kan enten blive løst ved hjælp af NMR eller røntgenkrystallografi, og strukturen af hele pili kan blive bestemt med cryo-EM. Ydermere, kan informationer om protein-protein interaktioner, støkiometri, ligandbinding osv. opnås med forskellige teknikker. Strukturen af den samlede pilus kan derefter modelleres ved at kombinere disse eksperimentelle data.

Arbejdshypotesen

Fra homologe pili systemer er det blevet vist at de ”minor” pilins danner et stabilt kompleks, bestående af 3-4 ”minor” pilins, som er medvirkende til at initierer formationen af pilusen. Under min PhD vil jeg afprøve denne hypotese på det pili system fra E. coli som jeg undersøger. Mit mål er at bestemme interaktioner mellem de “minor” pilins og bestemme strukturen af disse pilins, både individuelt og hvis muligt i kompleks.

Forskningsophold i Tübingen

Som en del af ViBrANT har vi muligheden for at besøge og arbejde i andre af de affilierede laboratorier som er en del af vores PhD-konsortium. Med dette øjemed var jeg to måneder i Tübingen i Thilo Stehles laboratorie ved Interfakultäres Institut für Biochemie på Eberhard Karls Universität Tübingen. Tübingen er en dejlig lille by, hvor naturen er lige uden for døren og byen er fyldt med studerende. Da jeg ankom til Tyskland havde jeg fortsatte problemer med min oprensning af mine proteiner. Det var rigtig brugbart at få nye øjne på projektet, få feedback og gode råd. Selvom opholdet ikke resulterede i markante gennembrud i forhold til projektet, var det en rigtig god erfaring at besøge og arbejde i et andet laboratorie. Mit ophold i Tübingen var oplyst af julelys og atmosfære som løftede stemningen i den kolde og mørke vinter.

Smukke omgivelser om aftenen i Tübingen.

I slutningen af opholdet tog jeg med på en tur til Swiss Light Source på the Paul Scherrer Institut in Switzerland. Denne tur gav et stort indblik i hvordan data bliver optaget under røntgenkrystallografi eksperimenter, som bliver brugt til at bestemme protein strukturer.

Public outreach

Iris besøgte laboratoriet, her venter vi på at kunne evaluere en gel der køre i baggrunden.

I løbet af den første uge af februar havde vi i laboratoriet besøg af en gymnasieelev. Vi viste hende blandt andet de grundlæggende principper i proteinoprensning. Ydermere forsøgte vi at engagerer hende i alle ode spændende ting man kan finde ud af med moderne videnskab og teknologi. Jeg viste blandt andet Iris hvordan man kan visualisere proteiner på SDS-PAGE  og de grundlæggende principper i affinitetskromatografi og andre kromatografiformer.

Share to social media

Back To Top