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Purification de protéines, pili de type IV et biologie structurale intégrative – une mise à jour depuis Paris

Le temps passe très vite dans le monde de la science. Vous commencez votre doctorat and soudainement la première année est déjà passée. En premier lieu, lorsque vous quittez l’environnement rassûrant de votre terre natale, vous passez du temps à essayer de vous adapter aux nouvelles coûtumes, à créer votre réseau professionnel et social, et enfin à vous installer dans votre laboratoire sur un nouveau projet passionant. Après une année, de nombreux challenges ont été surpassés et de nouveeaux objectifs ont été obtenus, à la fois professionnellement et personnellement.

Lorsque j’ai débuté dans les sciences et la biochimie, on m’a souvent dit que les expériences auraient un taux de succès de 10%. Par conséquent, on observe bien plus d’échec que de succès lorsque l’on réalise des expériences. Peut-être pas des échecs critiques, mais les résultats se révèlent différents de ce que l’on avait initialement imaginé. Au début d’un projet de biologie structurale, on doit produire et purifier des protéines en quantités raisonnables, avant de commencer des investigations plus poussées puissent être entreprises. Si tenter d’obtenir la protéine en question révèle des problèmes, le projet semble ralenti et entraîne l’utilisation de techniques plus sophistiquées, ce qui repousse encore plus dans le future son analyse. Cela fut le cas pour mon projet. Mais les nuages qui envahissaient le ciel ont apparemment laisse place au soleil qui brille maintenant sur ma purification de protéine au laboratoire.

Cela signifie que les investigations plus poussées se sont rapprochées. J’ai repris mes esprits car l’objectif principal du projet se rapproche peu à peu. Le titre de mon projet de doctorat décrit ce qui reste à venir: “Une stratégie intégrative pour la détermination structurale d’un pili bactérien de type IV”.

Pili de type VI

Le pili bactérien de type IV est un polymère protéique qui est étendu depuis la bactérieen vue de réaliser une fonction biologique. La fonction biologique de ce type de pili est très versatile : cela peut aider au mouvement de contraction permettant le déplacement, mais aussi amélioré l’infection de certaines espèces pathogènes. Une machine protéique très bien élaborée est en charge de l’assemblage du pili. Elle est localisée à la fois dans les membranes interne et externe des bactéries Gram négative. Cette machine protéique peut activement allonger ou rétracter le pili. Le pili lui-même est composé de milliers de blocs de protéines, appelées les pilines, qui peuvent être étendues jusqu’à atteindre une longueur de plusieurs µm.

Les pilines sont divisés en 2 groupes, les pilines majeures et mineures. La piline majeure est une seule protéine qui est présente en abondance par rapport aux pilines mineures. La piline majeure forme le tronc des pilus. Les pilines mineures sont bien moins abondantes, mais sont très iportantes pour la fonciton biologique du pili ainsi que sa formation. Mon projet est focalisé sur la détermination de la structure de ces pilines mineures et leur interaction. Ce travail est une extension du travail précédemment réalisé dans le laboratoire où la structure du pili composé de la piline majeure a été déterminé.

Détermination Structurale intégrative

La structure RMN de PpdD est modelisée dans la carte de densité électronique obtenue par cryo-électrotomographie.

Le consortium ViBrANT s’était mis d’accord sur les 15 ESR en rédigeant une mini-revue pour un numéro spécial de microbiologie médicale et d’immunologie. Ce fut une très bonne opportunité pour s’intéresser à la litérature et acquérir une connaissance approfondie du contexte du projet. De la lecture de nombreux articles, il est apparu très clairement que la détermination structurale des pili nécessite de nombreuses techniques structurales différentes. La structure des pilines individuelles peut être résolue par cristallographie, RMN ou rayons X. En utilisant la cryo-EM, des structures de basse résolution peuvent être obtenues. De plus, avec différentes techniques on peut obtenir des informations sur les interactions protéine-protéine, sur la stœchiométrie, la liaison au ligand, etc… La structure du pilus assemblé peut ensuite être modélisée en combinant ces données expérimentales.

L’hypothèse de travail

À partir de systèmes de pili homologues, les pilines mineures interagiraient pour former un complexe stable qui devrait initier l’assemblage du pilus. Cela a été montré pour d’autres systèmes. Au cours de ma thèse, j’examinerai cette hypothèse dans notre système chez E. coli. Je vais cartographier les interactions des pilines mineures et déterminer leur structure.

Détachement à Tübingen

En tant que membre de ViBrANT, nous avons la possibilité de visiter et de travailler dans d’autres laboratoires du consortium. À cet égard, j’ai passé deux mois à Tübingen dans le laboratoire de Thilo Stehle à l’Interfakultäres Institut für Biochemie. Tübingen est une charmante petite ville où la nature est juste en face, et la ville pleine d’étudiants. À mon arrivée en Allemagne, je luttais encore contre la purification des pilines. Il était très utile d’avoir de nouveaux yeux donnant des commentaires et conseils sur le projet. Même si ce détachement n’a pas entraîné de percée majeure dans la recherche, ce fut une très belle expérience que de visiter et de travailler dans un autre laboratoire. Le décor de mon séjour à Tübingen était également accompagné de lumières de Noël et d’une atmosphère qui m’a remonté le moral pendant l’hiver froid et sombre.

Jolis décors de nuit dans la ville de Tübingen.

À la fin du détachement, j’ai fait un voyage à la Swiss Light Source à l’Institut Paul Scherrer en Suisse. Ce fut un excellent aperçu de la collecte de données sur les structures cristallines aux rayons X.

Sensibilisation du public

Iris a visité le laboratoire et nous sommes entrain d’attendre pour analyser les résultats d’un gel SDS-PAGE qui migre derrière nous.

 

Pendant la première semaine de Février, un étudiant de collège a visité notre laboratoire à Paris. Nous lui avons montré les principes de base de la purification de protéines. De plus, nous avons essayé de l’impliquer dans des choses excitantes que l’on peut faire avec les sciences et technologies. Entre autre je lui ai montré comment voir des protéines sur SDS-PAGE et les principes de base de la chromatographie d’affinité et d’exclusion stérique.

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